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全面助力新药研发,挑战DDR靶点之DNA-PK

时间:2022-05-20 14:18:42 阅读:595

 背景介绍

  在细胞的生命周期中,每天都会由于内源性(DNA双链断裂)和外源性(紫外线辐射和化学毒性等)的因素而引起DNA成百上千次的损伤, 一旦细胞丧失了有效的修复DNA损伤的能力,就会导致细胞基因组的改变,转录过程出现错误,进而通过翻译过程影响到信号转导和细胞功能必需的蛋白质,可能使细胞出现衰老,凋亡和癌变。为了应对DNA损伤带来严重的不良反应,细胞进化出一个复杂的信号通路网络—统称为DNA损伤反应(DDR),它协调DNA损伤的检测、修复与细胞周期,以确保基因组稳定性和细胞生存能力的维持。DDR信号级联由一系列蛋白磷酸化驱动,ATM、ATR和DNA-PK是参与这一过程的关键激酶,是DDR的中枢调控因子。它们均属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKKs)家族成员,该家族还包含mTOR,SMG1.TRRAP,这些蛋白对细胞存活、增殖、代谢、分化具有重要作用。

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图1:PIKKs家族蛋白


  在真核生物细胞中最严重的DNA损伤是双链断裂(DSB),单个未修复的DSB可导致细胞死亡,错误修复的DSB可导致染色体畸变,如易位和缺失。双链DNA断裂(DSB)的修复可以大致分为三种主要途径:非同源末端连接(NHEJ),同源重组(HR)和聚合酶θ介导的末端连接(TMEJ),最初命名为替代末端连接(alt-EJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ)(图2)。

  (1) Canonical nonhomologous end joining (c-NHEJ): 通过DNA连接酶将两个断裂的DNA末端连接起来,无需修复模板。Ku蛋白(Ku70/Ku80)复合物是一种异源二聚体,其结构为篮状,具有容纳dsDNA末端的中心腔。Ku异源二聚体识别断裂的DNA,并招募DNA-PKcs结合并稳定DNA末端,随后募集其他NHEJ核心因子(如MRN复合物(MRE11–RAD50–NBS1)和重组酶(Artemis)处理DNA末端,最后募集LIG4-XRCC4连接加工末端,将其紧密对齐并连接起来。这种连接方式迅速且高效,是哺乳动物细胞中DSBR的主要途径,但可能造成一些序列缺失,同时也会造成一些片段的插入。

  (2)Homologous recombination (HR): 当细胞处于S/G2阶段后期时,姐妹染色单体出现,HR以未受损的姐妹染色单体的同源序列作为其修复的模板,首先对DSB进行末端切除,以产生3'端ssDNA,募集重组酶RAD51.介导侵入DNA双链模板,与同源DNA序列配对形成D-Loop结构,D-Loop延伸或与另一个末端连接,完成修复过程。尽管HR修复效率低,速度慢,但是它被认为是唯一精确的DSB修复途径,可使基因组得到完美修复。

  (3) Polymerase theta-mediated end joining (TMEJ):TMEJ是除了非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 (HR)之外,细胞的另外一种修复途径, 最初命名为替代末端连接(alt-EJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ), 后来被称为聚合酶θ介导的末端连接。TMEJ由PARP1发起,用于切除DNA末端,经磷酸化CtIP活化后,募集Mre11-Rad50-NBS1(MRN)复合物等酶,POLQ与DBS的5’-3’切除产生的长单链DNA(ssDNA)结合,并以2-6对微同源序列作为DNA合成的引物,然后用LIG3-XRCC 1或LIG 1连接稳定的DNA末端。

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图2:真核细胞中DBS 修复途径


DNA-PK结构及功能

  DNA-PK(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)即DNA依赖性蛋白激酶,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物,由与 DNA 结合的催化亚基 (DNA-PKcs) 和 KU70/80 异二聚体组成的660KDa的全酶复合物(图3),是PIKKs家族中最大的一种蛋白激酶,缺乏对脂质的活性。

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图3:DNA-PK结构示意图


  DNA-PK在几乎所有哺乳动物细胞中都大量表达,是c-NHEJ修复途径中的核心激酶。NHEJ在G1/S/G2期都可以起作用,它无需修复模板,可以直接将两个游离 DNA 末端连接起来。尽管可能引入修复错误,但哺乳动物细胞中的大多数DSB是由此途径修复的。DNA-PK本身并不能识别损伤部位,它需要一种辅助的蛋白因子Ku。当 DSB 存在时,NHEJ 通过 KU70/80 异二聚体识别 DSB 末端,随后将 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基 (DNA-PKcs) 招募到 DNA 损伤位点,结合并稳定DNA末端,随后募集其他NHEJ核心因子,将末端紧密对齐并连接起来(图4)。

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图4:DNA-PK功能示意图

  

DNA-PK与ATM的合成致死效应

  所谓“合成致死”是指两个或多个非致死基因的表达同时发生异常,包括突变、过表达或基因抑制,导致细胞死亡;而只有一个基因的异常不影响细胞活力(图5)。从1922年美国遗传学家Calvin Bridges发现黑腹果蝇中pd和 Pdr基因“合成致死”现象开始,直到2005年,英国的两个研究团队首次证实了PARP抑制剂与BRCA1或BRCA2突变之间存在“合成致死”的相互作用,才使得这一理论应用到实践中,由此拉开了“合成致死”抗癌的序幕。

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图5:合成致死效应示意图


  DNA-PKcs和ATM之间的合成致死性相互作用是在一项基于细胞的大规模筛查中得到证实的,在ATM缺陷的癌细胞中DNA-PK的化学或遗传故障可导致细胞死亡。ATM和DNA-PKC分别是同源重组(HR)和非同源末端连接(c-NHEJ)信号通路中的关键激酶,如果同时失活,则具有综合致死性。因此,ATM和DNA-PK之间的合成致死作用并不是基于它们的DNA修复相关功能,而是通过HR和c-NHEJ信号通路的综合致死作用(图6)。此外,DNA-PK的药理学抑制在携带多种HR因子突变的细胞中都是致命的,包括BRCA1、BRCA2、CHK2、Rad50、PTIP和PAXIP。DNA-PK和MSH3之间的合成致死性相互作用尤其令人感兴趣,因为MSH3在结直肠癌中经常发生突变,这种相互作用并不依赖于MSH3在DNA错配修复中的功能,而是依赖于其在HR中的作用。

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图6:DDR信号网络及DNA-PK合成致死效应原理

  

DNA-PK抑制剂

  近年来随着DNA损伤修复与合成致死靶点的持续火热,DNA-PK抑制剂的开发受到越来越多新药研发公司的青睐。NA-PK抑制剂的研发主要集中在DNA-PKcs的催化活性上,通过抑制DNA-PK的表达或活性来减少DSB的修复,从而促进肿瘤细胞对于放化疗的敏感性。目前尚未有获批的DNA-PK上市药物,但已有5款药物进入到临床期,分别是CC-115. AZD7648. M9831. Nedisertib和Nedisertib(图7)。对于DNA-PK靶点的研发尚未出现聚集扎堆现象,发展前景十分广阔。

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图7:DNA-PK抑制剂在研情况

  

结束语

  爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化,批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术,致力于以高效、专业的服务,帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。我们分别利用ADP-Glo方法和HTRF方法构建了DNA-PK和ATM这对合成致死搭档的抑制剂筛选方法。阳性药验证数据与文献接近,结果稳定可重复,适用于高通量抑制剂筛选。

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  数据来源:爱思益普


  ICE在DNA损伤领域积极布局,目前已经积累大部分DDR相关靶点的评价方法(如下表),同时也在积极拓展合成致死新靶点的方法优化和构建,欢迎垂询、沟通细节。

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  参考文献

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