DDR (DNA Damage Repair)是细胞识别和修复DNA损伤机制的统称。在细胞当中，细胞内源性正常的代谢活动和外源性的因子都可能引起DNA的损伤。DNA损伤可能引起多种后果，比如影响基因的正常转录、造成遗传物质的不稳定性以及后代细胞的活性。DNA损伤如不能及时得到修复，最终可能会导致肿瘤和癌症的发生。
DNA损伤的种类有很多种，比如DNA单链损伤、双链损伤或者碱基错配等等。针对不同的损伤种类，所涉及的修复信号通路和关键蛋白也有很大的不同。鉴于DDR与癌症发生的密切关系，DDR相关靶点和实验方法不仅是生物制药公司关注的热点，也一直是爱思益普大力发展的平台。

1.  DDR通路及靶点

针对不同的DDR通路以及靶点，爱思益普准备了从蛋白、酶学到细胞学的不同方法供客户选择。

 

图1. DDR相关通路及靶点

部分实验方法如下：

ü 针对聚合酶、解旋酶、核酸酶以及反转录酶活性的生化学方法

ü 细胞增殖、凋亡以及细胞周期检测

ü 化合物毒性检测

ü DDR通路报告方法

ü DNA损伤检测方法

 

1.1 蛋白纯化以及验证

爱思益普有着先进的设备和丰富的经验纯化验证DDR相关的蛋白。原核系统表达制备的蛋白周期一般为3-4周；真核系统表达制备的蛋白周期一般为6-8周。部分设备以及结果展示如下：

 

 

                          图2 部分蛋白纯化、验证设备

 

图3 部分DDR蛋白纯化结果展示

1.2 WRN靶点相关实验

WRN 是Werner’s syndrome protein的简称，其是RecQ DNA解旋酶家族的主要成员。 WRN蛋白广泛参与到核酸的复制、转录、重组和修复过程当中。WRN的突变会导致Werner综合征的发生，也被认为与肿瘤和多种其他疾病相关。

图4 人类RecQ家族蛋白

(Adapted from Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 39:79–97, 2004)

针对RecQ家族成员蛋白的不同功能结构域，爱思益普开发出来相应的酶学和细胞学方法来检测与其对应的活性，例如Unwinding Assay, ADP-Glo Assay,细胞增殖等。部分结果展示如下：

 

图5 WRN Unwinding Assay

 

图6 WRN ADP-Glo Assay

 

图7 SYBR Green Assay以及Fluorescent Assay。

 

图8 WRN靶点相关细胞学方法

 

图9 WRN一体化药物筛选平台

1.3 PARP/PARG靶点相关实验

Poly(ADP-ribose) polymerase 1（PARP1）是多聚ADP-核糖基转移酶家族的重要成员。作为DNA损伤修复中的先锋因子，PARP1被报道在损伤发生后的极短时间内就会被招募至损伤位点，通过多聚ADP-核糖基化XRCC1调控碱基切除修复（BER）。除此之外，它还被报道参与调控DNA双链断裂修复（DSBR）和核苷酸切除修复（NER）。PARP1是肿瘤治疗领域的明星分子，PARP抑制剂（PARPi）已被广泛运用于治疗多种肿瘤，尤其在BRCA1/2缺失的乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的临床治疗中显示出卓越的疗效。

 

与多聚ADP-核糖化相对，多聚ADP-核糖的水解在DNA损伤修复的过程中同样起到重要的作用。Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG)是多聚ADP-核糖水解酶的主要成员之一。

 

爱思益普针对PARP家族和PARG也设计并验证了一系列生化合细胞学的实验来助力化合物的筛选。

 

 

图10 PARP1/2相关酶学实验

 

图11 PARG相关酶学实验

 

图12 PARylation检测方法

 

图13 PARPi细胞增殖培养实验

 

1.4 POLQ靶点相关实验

DNA 聚合酶 theta 是一种在人类中由 POLQ 基因编码的酶。 这种聚合酶在三种主要的双链断裂修复途径之一中起着关键作用：Theta 介导的末端连接 (TMEJ)。 大多数双链断裂是通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组修复 (HDR) 修复的。 然而，在某些情况下，NHEJ 和 HR 的缺陷，使得TMEJ 成为修复DNA双链断裂的唯一方法。 因此，POLQ 是 HR 或 NHEJ 缺陷细胞中的合成致死的新靶标。

爱思益普针对POLQ靶点的化合物筛选也进行了积极地开发，其中包括业内领先的TMEJ Reporter Assay。部分方法和结果展示如下：

 

图14 POLQ相关酶学实验

 

 

图15 DNA Damage Foci Assay

 

图16 TMEJ Reporter Assay以及NHEJ Reporter Assay

 

图17 细胞增殖相关实验

 

图18 POLQ靶点CDX模型以及药效实验

 

图19 POLQ靶点一体化药物筛选平台

 

1.5 p53靶点相关实验

p53 是一种肿瘤抑制蛋白和转录因子，可调控细胞分裂，阻止DNA突变或受损的细胞进行分裂并通过转录调控向这些细胞传导凋亡信号，从而阻止肿瘤形成。针对p53靶点的酶学和细胞学的方法以及部分结果展示如下

 

图20 p53蛋白纯化、酶学以及细胞学方法展示

 

1.6 PRMT5-MAT2A靶点相关实验

PRMT（蛋白质精氨酸甲基转移酶）能够使多种蛋白甲基化，并在基因表达、剪接和DNA损伤修复等生物学过程中发挥重要作用。MTAP（methylthioadenosine phosphorylase，甲硫腺苷磷酸化酶）常与体内常见的抑癌基因CDKN2A发生共缺失现象，这种共缺失现象在肿瘤中的比例可达9%~15%。PRMT5在MTAP缺失肿瘤中的合成致死效应。另外，有研究证明，MTAP缺失的癌细胞对蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）也敏感。因此，PRMT5抑制剂和MAT2A抑制剂有望成为治疗MTAP缺失肿瘤的新一代靶向药物。

 

图21 PRMT5-MAT2A通路示意图。

 

图22 PRMT5-MAT2A酶学相关实验

 

图23 PRMT5-MAT2A细胞学相关实验

 

图24 HCT116-MTAP-KO CDX模型验证

 

2. Cell Panel筛选

爱思益普一直在积极扩展公司的细胞系库。目前公司已有接近600株的人源癌症细胞株。同时，我们也在积极构建DDR关键蛋白敲除、敲落以及过表达的工程细胞株，以满足广大药企对于不同癌种、药物敏感株、耐药株Cell Panel的筛选。

 

图25 Cell Panel筛选能力