据统计，约25-40%的先导化合物都显示出不同程度的hERG相关毒性。hERG的风险评价，已是新药研发的必须环节。目前，有多种技术平台，可供hERG检测选择，那么如何找到合适于自己的方法以免不合适的检测方法产生误导？思考和权衡起来不免令人纠结。基于此，本文就目前主流的hERG检测技术，做一些探究和梳理。

背景介绍：

人类ether-á-go-go-related基因（hERG）编码的快速延迟整流钾通道是心肌动作电位3期复极的重要离子通道，hERG基因的loss-of-function突变会导致2型LQT综合征（LQTS2），使心脏动作电位复极紊乱，易导致心律失常的发生和猝死。LQT综合征患者的心电图异常表现为Q-T间期延长，即心室开始去极化和复极结束的时间延长。同样的，大多数非抗心律失常药物也会发生类似的不良反应，这是由于hERG独特的通道结构，使这些药物对hERG通道的亲和力比对心脏其他离子通道的亲和力要强，导致药物对hERG通道呈现不同程度的抑制作用，从而使心脏复极期延长，过度的复极延长在某些情况下可能引发致命性心律失常：尖端扭转型室性心动过速（TdP）。据统计，约25-40%的先导化合物都显示出不同程度的hERG相关毒性，而且很多药物由于可能导致QT间期延长风险而被撤出市场。因此，先导化合物确定及优化阶段，对大量化合物进行hERG通道的抑制活性检测成为制药企业的常规做法。

hERG通道特性：

hERG通道由4个相同亚单位组成，每个亚单位具有6个跨膜螺旋区域，S4携带正电荷对电压敏感，S5，S6和环孔区构成通道孔，S6含有2个芳香族氨基酸，大多数药物阻断hERG就是结合这个位点。hERG通道结构的独特性体现在其不同寻常的失活特征，与其他电压门控钾通道不同，hERG通道的失活具有强烈的电压依赖性和时间依赖性。通道在~-10mV电压达到最大开放状态，随着刺激电压升高膜持续去极化，通道迅速进入失活状态，这种快速的电压依赖性失活是较大电压刺激下hERG电流幅度降低的原因，这属于C型失活。之后通道可在几毫秒内从失活状态迅速恢复，这会产生较大的尾电流，然后随着激活门关闭而缓慢衰减，呈现内向整流特性。在单个电压下测得的尾电流大小反映了前期去极化状态下hERG通道激活的通道数量，而我们要分析的也就是尾电流的大小。

hERG通道检测方法

最理想的hERG活性检测方法是在符合hERG通道特性的生理条件下进行hERG抑制活性的检测，最接近这种理想状态的方法是利用膜片钳技术对心肌细胞进行hERG电流的记录。然而，心肌细胞中hERG电流小大普遍较小，且技术难度较大，所以一般使用稳定过表达hERG基因的宿主细胞（HEK293或CHO细胞）进行替代。检测hERG通道的方法分为电生理学方法和非电生理学方法，传统的手动膜片钳技术和自动膜片钳技术属于电生理学检测方法，电生理学检测方法可提供受试物阻断hERG通道的作用强度及机制研究，电压钳记录的独特优势是能够控制膜电位，因为hERG通道的激活和失活依赖于膜电位的变化，而电压钳可以区分与通道不同状态进行相互作用的化合物。

手动膜片钳

手动膜片钳技术是离子通道研究的金标准，不仅能够提供高质量的数据，且能够根据每个化合物不同的结合特性调整给药时间，力求达到准确的阻断效应，但缺点是技术难度大，需要对技术人员进行长时间的培训才可独立检测，且成本高，效率低，无法实现在短时间内对成千上百个数量级的化合物进行快速筛选。此方法一般适用于重点化合物的验证工作。

自动膜片钳

自动膜片钳技术是最接近手动膜片钳的检测技术，提升检测效率的同时也能够得到高质量的高阻封接状态，灵活的电压刺激方案设计使得数据记录质量能够与传统的手动膜片钳媲美。QPatch系统采用的是基于硅芯片而不是玻璃微吸管的平行膜片钳技术，不需要操控玻璃微电极的微操纵器，也不需要显微镜，是膜片钳技术在方法学上的简化。实验时，单个细胞被自动吸引到硅芯片的微米孔上，仪器自动进行高阻封接和破膜，形成全细胞记录模式后由机械臂自动给予buffer和每个药物浓度。整体操作简单，但缺点是无法对实验细胞进行选择，故实验需要质量高度均一的细胞标本。与传统手工膜片钳系统相比，QPatch通过高度自动化和平行操作，大大提高了实验通量，降低了筛选成本。

我们公司使用的自动膜片钳设备是Sophion的QPatch II 48X，可同时钳制48个细胞，在无氟外液中也可实现快速的高质量高阻封接状态，并带有温控设备，可实现不同温度下hERG的检测需求。同时我们做了大量验证工作，选取了对hERG通道呈现不同抑制程度的28个化合物，与文献对比一致性较高（结果见下图），另外我们同步对比了手动膜片钳系统和QPatch系统的对于部分化合物hERG通道IC50值的大小，大多都能得到一致的结果。

此外，更多的非电生理学研究方法被开发用于离子通道的高等通量检测手段，如Ligand binding assay、Fluorescence-based assay、Flux assay等。

Ligand binding assay

Ligand binding assay属于结合实验，只能检测化合物与离子通道的亲和力强弱，不能区分激动效应和抑制效应，必须进行功能性实验进一步确定该化合物是否为激动剂或拮抗剂。此外，结合实验受到放射性标记配体的可用性和亲和力的限制，且结合实验中通常使用的药物暴露时间比其他功能性实验需要的时间更长，得到一个准确的IC50值需要一段相当长的时间才能达到稳定。

Flux assay

Flux assay和Fluorescence-based assay是能够在早期筛选阶段替代手动膜片钳和自动膜片钳的两种高通量功能检测方法。Flux assay利用了Rb+可通透hERG通道的能力，在细胞外液维持高钾环境下使细胞膜去极化，hERG通道开放，胞内Rb+流出细胞外，86Rb+作为放射性指示剂可计算出Rb+的流出量，以此评价药物对hERG通道的抑制程度。这种方法可以在96孔和384孔板内进行检测，每天可测试数千种化合物，但缺乏电压控制，无法达到生理状态下hERG通道的活动状态，通常情况下，Rb+通量检测得出的IC50值比电生理测定的IC50值高出10倍左右，但两种测试方法测试出来的化合物作用强弱顺序是相似的。

Fluorescence-based

Fluorescence-based assay检测hERG通道的抑制活性常用的是FLIPR®钾通道检测试剂盒的方法，检测原理是利用钾通道对铊离子(Ti+)的通透性，在细胞外高钾的状态下使细胞膜去极化，hERG通道开放，Ti+内流入细胞内，使用一种对Ti+高度敏感的指示剂染料与胞内的Ti+进行结合产生荧光信号。Ti+ 信号的强度与hERG钾通道在开放的程度成正比；这种方法提供了更直接的hERG活性检测方法，可与Rb+ flux方法一样达到高通量的活性检测目的。

我们实验室使用FLIPR®钾通道检测试剂盒的检测方法对hERG通道的抑制活性进行了反复验证工作，对不同化合物在不同实验天数进行了多次验证，均能得到3倍以内的IC50值（结果见下文）。

E-4031：

1st: 2nd:

Dofetilide:

1st: 2nd:

Primozide:

1st: 2nd:

结语：

我们公司构建了从高通量的Fluorescence-based assay到中等通量的QPatch assay，以及金标准的手动膜片钳三种检测平台，可实现不同阶段的筛选需求，极大程度的降低了hERG筛选成本及缩短检测时间，快速地推进先导化合物的优化过程。爱思益普在体外心脏安全性评价的工作上积累了10多年的经验，在与国内多家制药公司的合作过程中发现，在早期先导化合物筛选阶段及时评价化合物对hERG通道的抑制活性，可以很大程度降低药物研发后期带来的心脏安全性方面的困扰。

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