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高亲和力抗体的研发对于新冠病毒诊断和治疗具有重要意义。目前的两条主要研究策略,一是挖掘已开发的具有交叉保护活性的SARS病毒抗体,这种方法快速但与新冠病毒的亲和力较低。另一种方式是从感染患者中分离单克隆抗体,但是难以大规模分离制备。近日,日本名古屋大学的研究者开发了转录翻译偶联嘌呤霉素接头展示(TRAP)的新技术,在短时间内就可筛选出靶向新冠病毒刺突蛋白的单克隆抗体,并且对病毒中和效力显著,为快速开发新发传染病抗体提供了新的途径,研究结果发表在国际知名期刊 Science Advances上。
体外筛选技术是一类重要的抗体类似蛋白生产技术,这种技术避开了繁琐的动物免疫,而利用免疫蛋白支架如单链可变区、单域抗体、非免疫球蛋白,快速筛选抗体库。经典的方法包括噬菌体展示技术、mRNA展示技术等,然而噬菌体肽库太小,而mRNA肽库构建又耗时过长。研究者在前期研究开发了一种高通量筛选体外功能肽段的方法,即TRAP技术:DNA模板加入体系后,在T7聚合酶催化下转录为mRNA,迅速结合嘌呤霉素-DNA接头,由核糖体进行翻译,嘌呤霉素再连接到多肽链上,逆转录、免疫沉淀后筛选功能多肽,再通过PCR扩增进行下一轮筛选。
TRAP体外筛选
研究者发现,单抗体的DNA 3'模板会不依赖启动子转录形成杂交链阻碍后续反应,因此需要通过引入甲氧基修饰阻碍无效转录,实验结果明显提高了展示效率。同时研究者也注意到首轮筛选时存在抗体库种类有限的问题,于是通过外源添加mRNA库,提高了抗体多样性。EGFR1、HER2的抗体筛选证实了该方法的有效性。
为了构建新冠病毒抗体库,研究者首先在单抗体BC、FG环上引入随机突变,并采用含多种密码子的混合液进行随机库构建。同时预先构建了大规模的mRNA库,在后续多轮筛选中可以扩充多样性靶向多种位点。研究者针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基和受体结合结构域进行TRAP筛选,第一轮采用mRNA库作为模板,后续逐步筛选高亲和力抗体,经过6轮筛选在3-4天内就获得了单抗株。研究者选取了其中丰度最高的9株抗体,进行生物活性的测定。酶联免疫吸附实验(ELISA)显示不同抗体均可以与S1亚基RBD结构域结合,在37℃均保持稳定,部分抗体在50℃依然保持活性。生物膜层光干涉实验进一步测定了抗体结合动力学参数,7株抗体表现出亚纳摩尔至纳摩尔级别的亲和力。
酶联免疫吸附和亲和力常数测定
抗体阻断ACE2-S1结合
夹心ELISA检测
研究者进一步分析了抗体对完整病毒颗粒的结合能力,免疫磁珠结合RT-PCR显示了抗体有效结合并沉淀了病毒粒子。利用这种抗体免疫磁珠偶联RT-qPCR的方法最低可以在1uL液体中检出0-1个病毒粒子。为了说明该方法可以应用于临床快速检测,研究者又对COVID-19患者鼻拭子进行了“pull down”偶联RT-qPCR的方法,检出率明显高于传统qPCR,但是由于患者体内存在中和抗体,有一定程度干扰。
pull down qPCR与传统qPCR比较
为了进一步提高抗体的结合能力,研究者试图将抗体形成并列二聚体的结构,选取其中三株构建二聚体,亲和力明显提高,达到亚皮摩尔级别。这主要是二联抗体能够通过桥联作用与抗原形成网络状结构所致。
二聚体亲和力
6号单克隆抗体及其二聚体具有最高的亲和力,研究者推测该抗体可能有效阻断病毒感染。在表达TMPRSS2的VeroE6细胞单抗体能够有效抑制新冠病毒,IC50达到亚纳摩尔。
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