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hERG试验中供试品浓度损失研究

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溶解度不良、稳定性较差以及供试品经灌流系统的吸附是导致供试品真实浓度损失普遍存在的因素,导致hERG试验结果的严重偏差。


研究背景

药物所引起的QT间期延长(长QT综合征)与严重室性心律失常、尖端扭转性心动过速的风险增加有关。hERG(一种和心脏动作电位复极密切相关的钾通道)的抑制是非心脏药物导致QT间期延长的最常见原因,ICH S7B描述了新药所需的临床前安全性测试,这其中就包括hERG IC50的测定。由于不同化合物的溶解度、稳定性及供试品经灌流系统会存在损失,导致实际浓度和目标浓度可能不同,这些显著差异将使体外检测得到的浓度-效应曲线产生显著偏差,这会对药物安全性的评价带来不可忽视的错误。为了科学的规避这些差异,爱思益普供试品分析部利用超高效液相色谱对供试品溶液进行了分析,研究细胞外液中供试品的实际浓度与目标浓度的对比,来确定两个值之间差异的原因。通过试验结果,我们总结了一套关于细胞外液中化合物游离浓度的分析方法,并得到以下结论:考虑供试品溶液浓度分析时的最佳做法是(1)确定化合物在生理缓冲液中的溶解度(2)给药的浓度梯度应低于化合物在生理缓冲液中的最大溶解度(3)分析从灌注室收集的样品并在样品收集的当天分析样品(4)将实测浓度代替标识浓度来拟合浓度-效应曲线,得到更加真实的IC50

分析方法

使用超高效液相色谱(UPLC)仪器根据不同的化合物的化学性质进行方法建立,对化合物的稳定性、线性、准确度进行数据收集,使用Waters Corporation的Empower软件测量供试品的峰面积。使用Microsoft Excel 2010版进行描述性统计,包括算术平均值(平均值)和标准差、CV%(变异系数)和RE%(相对误差)。使用公式RE%=100×(实测浓度均值−标识浓度)/标识浓度。使用损失率Loss%=( 标识浓度-实测浓度均值)/标识浓度。制剂溶液浓度准确度或稳定性合格的验收标准RE%≤±10%。

影响因素

1.由于超过溶解度极限而导致实际浓度降低由于超过溶解度极限而导致实际浓度降低,在平时试验过程中我们遇到了许多情况,即供试品在DMSO或乙醇等溶剂中溶解度较好,但在生理缓冲液(pH=7.2–7.4)中的溶解度未知。我们在试验中设计配制一个浓度比较高的单点制剂,并测定了它对hERG通道的抑制率。具体试验如下:首先用DMSO将化合物配制成40mM的母液,再用细胞外液对母液进行200倍稀释后,肉眼观察到有大量的白色沉淀,然后用0.2μm的过滤器对供试品溶液过滤后给药,利用液相色谱法对回收进行检测,测定实际浓度结果为4.21μM与200μM存在很大的差异,相对误差为-97.90%。这种差异主要来源于化合物在外液中的最大溶解度。详见表1.1,1.2,1.3和1.4。
(1)液相分析条件

1.1液相分析条件



(2)制剂配制方法

1.2 母液配制方法


1.3 制剂配制方法

(3)试验分析结果

1.4 供试品浓度分析及抑制率检测结果


含有可见沉淀物的溶液会干扰膜片钳测定所需的吉欧(GΩ)封接,从而使hERG测定不稳定。有些溶液中的沉淀物即使在显微镜下也无法观测到。在测试此类制剂时,实际浓度可能与目标浓度有显著差异。示了一个化合物的例子,其中沉淀不可见,但2μM、3μM和10μM的浓度在相同程度上抑制了hERG电流。该结果表明在hERG缓冲液中的溶解度有限或部分拮抗作用随后测试该制剂的溶解度测定供试品在hERG缓冲液中的溶解度极限为1.8μM正是对hERG电流的影响开始趋于稳定的地方。试验结果表明,该化合物有限的溶解度导致了hERG通道无法完全抑制。

数据来源于Joμrnal of Pharmacological and Toxicological Methods 59 (2009) 29–34

2 供试品稳定性差导致浓度降低

一些供试品在生理缓冲盐(如K-007-1)中稳定性很差,为了验证化合物在生理缓冲盐中稳定性差而导致的化合物浓度减低,我们也进行了某一供试品的分析试验:将配制好的制剂进行首次分析,在室温遮光的条件下放置数小时后,通过准确度偏差来判断化合在生理缓冲盐体系中的室温稳定性。首次分析通过的样品0.30μM、3.00μM、30.00μM准确度偏差分别为-3.33%、7.78%和9.21%。室温放置8小时后准确度偏差分别为-22.22%, -15.33%和-2.71%。其中0.30μM、3.00μM的制剂稳定性未通过。


(1)液相分析条件

2.1液相分析条件

(2)供试品分析结果

2.3配制制剂室温放置8小时试验结果

有文献报道在遵循GLP指南对37个化合物稳定性进行评估的试验中,评估了在各种条件下37个化合物的稳定性。制备样品后,样品在两种条件下储存(室温和冷冻),8小时后分析样品,并与时间0进行比较。,对一部分供试品评估了更长的稳定性时间(24小时)(表3),可接受的稳定性定义为储存后浓度变化≤10%。在评估的37项研究中,有5个化合物在室温下储存8小时后进行分析时,供试品的稳定性失败;其中3个化合物在较短的存储期内进行了分析,因此,在大约10%的研究中,不稳定性发生在3或6小时至8小时之间。室温储存24小时后,又有3个供试品稳定性失败,因此,本组研究中,22%(37份中的8份)的供试品在室温下24小时不稳定。当在冷冻条件下储存时,4个供试品在8小时后不稳定,另外两个供试品在24小时后不稳定,即16%的供试品在冷冻条件下24小时,稳定性失败;同时,在冷冻条件下24小时后失稳的每种供试品,在室温下24小时也失稳。




数据来源于Joμrnal of Pharmacological and Toxicological Methods 59 (2009) 29–34



3 供试品经灌流系统存在的损失(吸附)在电生理灌流试验中,配制好的制剂经灌流系统后作用于细胞上,为了测定供试品经灌流系统后造成的损失,我们将准确度分析通过的制剂样品,经灌流系统后进行回收测定,统计数据并计算与标识浓度相比的损失率。0.30μM, 1.00μM,3.00μM, 10.00μM, 30.00μM配制时的浓度平均准确度偏差分别为-6.67%,-3.67%,-7.11%,-3.17%,-7.30, 供试品经灌流系统后0.30μM, 1.00μM,3.00μM, 10.00μM, 30.00μM损失率为76.67%,49.00%,38.67%,21.03%,16.17%。详见表3.1,3.2和3.3。

(1) 液相分析条件

3.1液相分析条件