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《爱求索》之Kinesin 家族的研究进展

来源:2023-01-17 10:34:43 浏览量:8608

背景介绍

1982年,通过冷冻蚀刻电子显微镜观察到细胞器和微管之间存在短跨桥,而这一跨桥对应于驱动蛋白和动力蛋白,这两种蛋白质均利用水解ATP提供动力驱动微管进行特定方向性的移动。最初从鱿鱼组织中分离出来的KIF被鉴定为轴突转运的驱动蛋白,普遍存在于所有真核生物中。驱动蛋白超家族蛋白(KIFs)在纺锤体组装和有丝分裂过程中承担多种任务,可作为微管稳定剂和解聚剂。在有丝分裂过程中,由微管(MTs),αβ-微管蛋白异质二聚体的极性聚合物所构成的纺锤体组织染色体分离,保障染色体的稳定性,其组织和动力学由KIFs驱动。此外,KIFs还参与了细胞器(线粒体和核糖体)的定位与运输,纤毛发生以及树突和轴突中神经信号的转导。目前已在人类中发现了45个具有不同功能的KIFs,根据氨基酸序列和结构差异,它们被分为14个亚家族(Kinesin 1-14)。驱动蛋白家族成员18A (KIF18A)是45种驱动蛋白之一,与KIF18B,KIF19A和KIF19B同属于Kinesin-8家族。KIF18A主要位于细胞质和细胞核中,由898个氨基酸残基组成,分子量为100 kDa。KIF18A在多种细胞过程中起着至关重要的作用,包括细胞分裂、微管动力学和细胞器运输。通过调节着丝粒-微管的附着,进而影响细胞分裂过程中的染色体定位,KIF18A的缺陷导致染色体不稳定,干扰KIF18A功能可能会导致细胞转化和致癌。多项研究表明,KIF18A在多种癌细胞中发现具有高表达,且与乳腺癌、透明细胞肾癌和结肠癌患者的预后相关,还参与了肝细胞癌的侵袭和转移并与细胞增殖、肿瘤分期和多发性肿瘤的预后相关。因此,KIF18A是一种可能的癌症预后生物标志物,也是抗有丝分裂治疗的潜在靶点。


驱动蛋白结构与功能

KIFs家族结构由一个高度保守的运动结构域,卷曲螺旋域和pH结构域组成。运动结构域提供了与微管的运动结合,又因其具有三磷酸腺苷(ATP)活性和微管依赖性运动电位,从而允许通过将ATP水解产生的能量与力产生耦合,沿着微管进行运动。运动结构域对于KIFs家族功能极为重要,因此根据运动结构域在分子中的位置,将KIFs家族分为三类:N型驱动蛋白在氨基末端区域具有运动结构域,M型驱动蛋白(KIF-13)在中间区域具有运动结构域,C型驱动蛋白(KIF-14)在羧基末端区域具有运动结构域。一般来说,N型驱动蛋白和C型驱动蛋白分别提供微管正、负端定向驱动能力,M型驱动分子将微管解聚成微管蛋白分子。大部分驱动蛋白作用为从微管正端定向驱动能力,因此家族中大部分驱动蛋白均属于N型驱动蛋白(如图2.1)。




图2.1 Kinesin家族按运动结构域位置分类



KIF18A由N端运动结构域、特定的颈部区域、中央线圈域和C端尾部域组成,属于N型驱动蛋白(如图2.2)。KIF18A的运动域介导ATP依赖的微管蛋白正端定向滑动,并经历核苷酸依赖的构象变化,这与其他正端定向驱动蛋白的结构重排类似,其运动域的三维结构显示存在loop2 (L2, 46-67个氨基酸),loop9, loop10和Mg2+ ADP(如图2.3)。带正电荷的L2对于与k纤维正端的稳定相互作用和纺锤体长度控制至关重要。在酿酒酵母中,KIF19A的L2对连续性和正端积累是必需的,但对解聚酶活性不是必需的。KIFs家族中Kinesin-13的L2组装成一个反平行β片,并与KVD指连接,用于微管解聚。但在Kinesin-8中不存在刚性KVD残基,证实驱动蛋白L2的结构差异是驱动蛋白在微管蛋白生物活性不同的主要原因。此外,KIF18A具有相对较长的颈部连接器,以实现结构灵活性,也是解聚酶活性不可或缺的区域。


图2.2 KIF18A蛋白结构域组成



图2.3 KIF18A蛋白3D结构


KIF18A调节微管动态,以限制着丝点振荡振幅并增加姐妹着丝点之间的张力。KIF18A介导的微管突变促进将主要作用于附着在滞后着丝点上的较长微管,增加姐妹着丝点之间的张力,并通过减少聚合态的同步性,限制振荡振幅(如图2.4)。KIF18A的损耗将增加附着在先导着丝粒上的微管的缩短速度,并且,通过降低附着在滞后着丝粒上的较长的微管的突变频率,增加聚合状态的同步性。过表达KIF18A会产生相反的效果。



图2.4 KIF18A调节微管机制


细胞周期失调导致肿瘤细胞增殖增强,G2/M检查点是细胞增殖调控的关键检查点之一。在肿瘤发生和发展过程中,细胞分裂不受控制,染色体聚集受到异常机制的驱动,有丝分裂有助于改变细胞周期。KIF18A在有丝分裂中的关键作用,也因此表明KIF18A在细胞转化和致癌过程中起着关键的调节作用。缺失KIF18A可影响关键有丝分裂功能,从而抑制有丝分裂和细胞分裂。通过基因共表达网络分析,KIF18A共表达基因富集最重要的途径是细胞周期信号转导途径(如图2.5)。目前研究表明KIF18A通过调节细胞周期信号通路干扰癌细胞增殖、侵袭和迁移,人乳腺癌细胞中KIF18A表达的下调会导致G2/M细胞数量的增加;肝癌细胞中敲除KIF18A后细胞周期蛋白B1等细胞周期相关蛋白的表达降低。


图2.5 KIF18A共表达基因的基因本体论和途径富集分析(A)分子水平(B)细胞成分(C)生物进程(D)KEGG


此外,KIF18A通过调控微管动态和有丝分裂促进癌细胞增殖。KIF18A在诱导的肝癌模型中表达上调,KIF18A缺陷后通过钝化PI3K- AKT通路保护肝癌不发生癌变,证明了KIF18A在肝癌进展中的重要意义及其在体内的功能作用。因此,KIF18A成为肝癌治疗干预的靶点。也可作为诊断肝癌的生物标志物(如图2.6)。


图2.6 KIF18A引发肝癌机制


KIF18A药物研发进展

细胞周期控制改变和染色体不稳定是许多侵袭性人类实体瘤的共同特征。近年来,人们对新型治疗方法的发展产生了浓厚的兴趣。有丝分裂就是一个经过验证的干预点,许多抗有丝分裂药物在临床上被用于治疗人类癌症。目前针对抗有丝分裂药物研究的主要方向是微管靶向药物,而有丝分裂中由微管蛋白组成的纺锤体引起了研究者的广泛关注,并成为癌症化疗的有效靶点。紫杉酚和长春花碱这类抗有丝分裂药物已成功应用于临床。然而,这些梭形毒素有一定的局限性,因为肿瘤细胞可能通过微管蛋白突变、药物外排泵过表达或微管蛋白亚型表达改变而对这些药物产生耐药性。因此,寻找靶向有丝分裂纺锤体的其他方法具有重要意义,这可能需要克服一些毒性和耐药机制。分子BTB-1被确定为一种特异性抑制KIF18A的抑制剂。与许多HsKIF11抑制剂相比,它作用于MTs结合的KIF18A,BTB-1结合袋位于KIF18A运动结构域内两个子结构域的交界处,抑制了KIF18A中核苷酸依赖的子结构域重排,从而阻断了运动性和MTs解聚。尽管该结合位点与HsKIF11中变构抑制剂的结合位点非常接近,作用于L5,但BTB-1选择性地结合KIF18A的MTs结合构像,靠近KIF18A特异性残基。这项工作指出了运动蛋白抑制的一般模式,其中小分子通过结合在运动蛋白运动结构域的子结构域来阻止子结构域重排列,或运动结构域困在MTs上,或阻止MTs结合(如图3.1)。


图3.1 BTB-1抑制KIF18A作用机制


KIF18A-IN-3也是一种有效的KIF18A抑制剂(IC50=61 nM)。KIF18A-IN-3与KIF18A的结合位点位于螺旋α4和α6之间的变构袋。这类抑制剂结构中一个磺胺氧与Ser262的主链酰胺N-H形成氢键相互作用。此外,乙基磺酰胺链上的羟基与α-微管蛋白Glu414的羧酸盐形成了分叉氢键。Tyr348的侧链与携带磺胺基团的苯环形成面对面的堆叠相互作用。KIF18A-IN-3导致有丝分裂显著停滞,并增加肿瘤组织中有丝分裂细胞的数量,已用于肿瘤研究(如图3.2)。


图3.2 添加吡嗪环KIF18A-IN-3抑制活性增强



结束语

爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化,批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术,致力于以高效、专业的服务,帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。在KIFs家族中,我们构建了ADP-Glo方法用于筛选驱动蛋白抑制剂。测定结果显示KIF18A阳性药AMG650的IC50稳定在25 nM左右(如图4.1),而同家族其他靶点均表现为无效。上述实验结果均稳定可重复,适用于快速、通量的小分子抑制剂筛选。




同时,我们也构建了CTG和细胞核染色的方法来筛选KIF18A抑制剂对肿瘤细胞增殖的影响。


图4.1 Data from ICE




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参考文献

[1] Hirokawa, Nobutaka. “From electron microscopy to molecular cell biology, molecular genetics and structural biology: intracellular transport and kinesin superfamily proteins, KIFs: genes, structure, dynamics and functions.” Journal of electron microscopy vol. 60 Suppl 1 (2011): S63-92

[2] Miki, Harukata et al. “Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.” Trends in cell biology vol. 15,9 (2005): 467-76.

[3] Hirokawa, Nobutaka et al. “Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.” Nature reviews. Molecular cell biology vol. 10,10 (2009): 682-96.

[4] Synthesis and Biological Evaluation of Optimized Inhibitors of the Mitotic Kinesin Kif18A[J]. 2014.

[5] Locke, Julia, Joseph, et al. Structural basis of human kinesin-8 function and inhibition.

[6] Kasahara, Mai et al. “Clinicopathological relevance of kinesin family member 18A expression in invasive breast cancer.” Oncology letters vol. 12,3 (2016): 1909-1914.

[7] Nuria A. Tamayo, Matthew P. Bourbeau, Jennifer R. Allen, Kate S. Ashton, Jian Jeffrey Chen, Matthew R. Kaller, Thomas T. Nguyen, Nobuko Nishimura, Liping H. Pettus, Mary Walton, Brian Belmontes, Jodi Moriguchi, Kui Chen, John D. McCarter, Kelly Hanestad, Grace Chung, Maria Stefania S. Ninniri, Jan Sun, Leszek Poppe, Chris Spahr, John Hui, Lei Jia, Tian Wu, Upendra P. Dahal, Katheryne Z. Edson, and Marc Payton Journal of Medicinal Chemistry 2022 65 (6), 4972-4990.

[8] SU X, QIU W, GUPTA ML JR, et al. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8.[J]. Molecular cell,2011,43(5):751-763.

[9] Zhu, Houbao et al. “Targeted deletion of Kif18a protects from colitis-associated colorectal (CAC) tumors in mice through impairing Akt phosphorylation.” Biochemical and biophysical research communications vol. 438,1 (2013): 97-102.

[10] Weiwei Luo,Minjun Liao,Yan Liao,Xinhuang Chen,Chunyan Huang,Jiyuan Fan,Weijia Liao.The role of kinesin KIF18A in the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].World Journal of Surgical Oncology,2018,16(1).

[11] Gardner, Melissa K et al. “Kinesin-8 molecular motors: putting the brakes on chromosome oscillations.” Trends in cell biology vol. 18,7 (2008): 307-10.

[12] Messin, Liam J, and Jonathan B A Millar. “Role and regulation of kinesin-8 motors through the cell cycle.” Systems and synthetic biology vol. 8,3 (2014): 205-13.[13] Zhong, Yonglong et al. “Overexpression of KIF18A promotes cell proliferation, inhibits apoptosis, and independently predicts unfavorable prognosis in lung adenocarcinoma.” IUBMB life vol. 71,7 (2019): 942-955.