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《爱求索》-Let-7 miRNA的故事

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miRNA也称为microRNA,是一类进化保守的大小为18~25 nt的非编码小分子RNA[1-2]。1993年,第一个miRNA lin-4在秀丽隐杆线虫中被发现,直至2001年miRNAs才被正式命名为一类具有调控功能的RNA。至今在生物界中已发现了2000多种miRNAs,其在生物发生发展中发挥重要作用[3]

一、Let-7 miRNA家族特征及命名分类

1.1 Let-7 家族特征第一个miRNA lin-4被发现的7年后,lethal-7(let-7)miRNA被发现[3]。到目前为止,共发现了13个let-7家族成员, 即let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miRNA-98和miRNA-202[3-5]。let-7编码9种成熟体,成熟体间有相似的种子序列,且成熟体间只有几个碱基的区别,也因此具有相似的生物学特性[6]。通过BLAST等软件计算分析,从miRBase序列数据库中记录的223个物种中共发现28645个miRNAs。其中秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、热带爪蟾、斑马鱼、鸡、狗、小鼠和人类都表达let-7(let-7a)相同的序列“UGAGUAGUAGUGUAGU”(图1),其中“seed sequence”种子序列区 (5’端的2-8nt) 通过序列互补原则靶向 mRNA的3’UTR区域进行作用。Let-7的广泛存在性和序列保守性表明let-7可能是不同动物物种基因表达的调节因子[7-8]


图1不同物种let-7家族的相同成熟let-7 (let-7a)序列


图1注:种子序列用黄色方框表示。一致的成熟序列被放置在顶部,大写字母为完全对齐的序列。


尽管let-7序列从线虫到人类都很保守,但不同动物物种的let-7家族成员之间存在一些差异[9]。线虫和苍蝇只有一个let-7 miRNA,高等动物(如鱼类和哺乳动物)则有多种相似的let-7家族成员,包括let-7a、-7b、-7c、-7d、-7e、-7f、-7g、-7h、-7i、-7j、-7k(表1)[10-13],但也有细微的差异,例如,let-7h存在于斑马鱼中,但不存在于人类中,且每个let-7家族成员在高等动物的基因组中有多个副本存在(表1)。


表1 不同物种let-7家族的特征


表1注:成熟的let-7家族成员(let-7a,-7b,-7c,-7d,-7e,-7f,-7g,-7h,-7i,-7j,-7k,和miR-98)及其相应的前体在秀丽隐杆线虫,黑腹果蝇,斑马鱼,小鼠和人中都有出现。


1.2 Let-7miRNA命名及分类

为了区分不同的亚型,高度同源的序列在数字后加上英文小写字母(a,b,c,…),如let-7a和-7b。表达相同序列不同基因组位点的则用数字表示,如人let-7a-1、let-7a-2和let-7a-3的前体分别编码在第9、11和12号染色体上,但都产生相同的let-7a miRNA(图2和表1)。因此,在给定物种的基因组中编码前体序列的数量可以不同于在该物种中表达的成熟miRNA的数量。例如,在人类中,12个不同的基因座编码9个成熟的let-7 miRNA(图2和表2)。通常一个miRNA前体很可能两个臂分别产生miRNA,则继续在名称之后加上-5p/-3p等,如let-7f-5p。根据前体的基因组定位又可分为四个基因保守簇。


图2 人类let-7家族成员成熟形态的序列比对


图2注:人类let-7家族成员成熟形态的序列比对。深蓝框表示一致性超过70%,浅蓝色框表示一致性超过50%。一致的成熟序列被放置在顶部,大写字母为完全对齐的序列。


表2 人和黑腹果蝇let-7家族的基因组定位和基因保守簇

表2注:本图描述了这些前体的基因组位置和四个簇。人和蝇let-7家族的前体可以单独定位(let-7g,-7i),也可以作为簇(簇1至簇4)定。


二、Let-7 miRNA作用方式

Let-7家族的作用方式遵循miRNA的典型作用方式。具体发生途径如图3所示[14]在细胞核内,RNA聚合酶II从编码基因组位点产生一个具有5 '帽和3 'PloyA尾的初级miRNA(Pri-miRNA),Pri-miRNA中的内部碱基配对形成了一种特有的约长33bp的发夹茎环结构。随后由RNaseIII酶Drosha和辅助因子双链RNA结合蛋白DGCR8(也称为Pasha)组成的复合体进行处理,切割成60-70nt长且具有2nt长的3’末端突出前体miRNA(Pre-miRNA)。经过Drosha/DGCR8复合体的处理后,依赖于Ran-GTP蛋白的转运蛋白Exp5可识别Pre-miRNA 3’末端突出的2nt与之结合。Pre-miRNA/Exp5/RAN-GTP复合体通过核孔复合物从细胞核输出到细胞质中,同时GTP被水解,Pre-miRNA随后解离。Pre-miRNA进入细胞质后,被Dicer酶和TRBP(反式激活应答 RNA 结合蛋白)从茎环基部的固定长度处切开去除环,形成19-23 nt左右的成熟双链miRNA (引导链miRNA和随从链 miRNA*),成熟双链miRNA与Argonaute (Ago) 蛋白和Dicer酶一起构成RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC),随从链 miRNA*随后被降解移除,形成单链成熟miRNA。单链成熟miRNA的种子区域 (5’端的2-8 nt) 通过序列互补原则靶向 mRNA的3’UTR区域,可直接抑制翻译,或可导致 mRNA不稳定,从而降解靶蛋白。尽管成熟的let-7通常遵循典型的miRNA生物发生途径,但是一些let-7家族成员需要额外的步骤来发挥作用。基因簇2组的Pre-miRNA前体在加工部位旁边有一个膨胀的腺苷(Pri-let-7d)或尿苷(let-7a-1,-7f-1),Drosha无法识别这种尿苷/腺苷隆起,导致产生单核苷酸3’突出末端,由于这种结构差异,需要一个额外的步骤以确保在生物发生过程中有效的Dicer酶活性,所以在此步骤中,末端尿苷酰转移酶(TUT2/PAPD4/GLD2,TUT4/ZCCHC11和TUT7/ZCCHC6)特异性地对基因簇2组的Pre-let -7s的3’端进行单尿苷化,产生Dicer酶偏爱的双核苷酸3’突出末端[15]


图3 Let-7家族的作用方式


三、Let-7家族与疾病的研究进展

3.1 Let-7 miRNA与免疫:

机体应对外部病原体感染的最早的免疫应答称为先天免疫,适应性免疫是机体针对特异性外来病原体分泌免疫球蛋白或促进免疫淋巴细胞活化的免疫。前者主要为 B淋巴细胞介导,后者则主要与T淋巴细胞相关。Let-7家族与先天性免疫及适应性免疫有关。

在先天性免疫中,Let-7主要参与免疫相关因子Toll样受体TLRs、巨噬细胞、树突状细胞DCs及NK细胞的调控。let-7b过表达调节TLR4的表达,显著改善了AIEC感染IL-10 KO小鼠结肠炎的严重程度[16]。let-7f-5p参与PMMA诱导的M1巨噬细胞极化,促进PMMA诱导的骨溶解[17]let-7b在体外可作为TLR7激动剂激活TAMs/TIDCs,抑制IL-10的产生[18]。Let-7可通过靶向 ZBTB16 mRNA的3’UTR,抑制 PLZF蛋白的表达,调节NKT细胞分化趋向和效应功能[19]。在适应性免疫中,通过抑制T细胞非依赖性抗原诱导的IgM抗体的产生,在活化的B细胞中,let-7a-1/let-7d/let-7f-1起着“代谢制动器”的作用[20]。let-7a可以抑制CD4+T细胞中IL-13的表达[21],调节性T细胞可以通过分泌含有let-7的外体来阻止 CD4+T辅助细胞的分化[22]CD8+T细胞中维持幼稚表型需要较高水平的let-7表达,而细胞毒性 CD8+T淋巴细胞(CTL)的产生依赖于 T细胞受体介导的let-7下调[23]


3.2 Let-7 miRNA调节组织器官发育:

Let-7 还可以调节组织器官发育。1et-7能直接或问接地作用于相关的细胞周期基因如A2、CDC34、E2F5、CDK8、CDC25A等,抑制细胞增殖[24-25]。Let-7在脑发育过程中上调表达,在大鼠脑皮质中特异表达,let-7和let-7b在下丘脑中高表达,在神经系统分化过程中上调表达[26]。胚胎期不同发育时期小鼠的心脏中1et-7a,7d,7e,7f)随着妊娠期的延长呈上调表达[27]。Let-7在正常肺脏组织中高表达,抑制let-7功能后,A549肺癌细胞的分裂增加,在肺癌细胞中过表达let-7会减少细胞分裂,改变细胞周期进程[28]。Let-7通过调节IL-13的分泌作用参与骨骼肌糖代谢过程,进而影响骨骼肌的发育[29]


3.3 Let7 miRNA在疾病中的通路调控:

RAS基因是人类肿瘤中最常见的癌基因,其家族中主要成员为H-ras、K-ras和N-ras。RAS信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长,RAS蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖[30]。在肺癌中,K-ras基因被认为是启动癌变的关键基因之一。对非小细胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及癌旁组织中let-7和K-ras基因进行检测结果显示癌组织中的K-ras表达上调,相应的let-7表达下降,证实let-7与 K-ras共同参与了NSCLC的发生及发展的过程[31]。let-7作用于RAS还可以抑制p-ERK的表达,进而调控MAPK信号转导通路,使G0/G1期肺癌细胞比例增加[32],见图4A和图4B。


图4 转染-let-7a后Ras、ERK 在KUM-LK2、A549、H446 细胞中的表达

注:A:转染组及对照组肺癌细胞中Ras、p-Ras、ERK、p-ERK蛋白的表达差异:B:Ras、p-Ras、ERK、p-ERK表达差异的直方图; * P<0.05,**P <0.01,与未转染组比较。


高迁移率蛋白A2(high mobility group A2, HMGA2)是HMGA蛋白家族成员之一,参与肿瘤的迁移以及侵袭过程。Let-7a能够显著下调HMGA2基因和蛋白的表达,抑制喉癌细胞的增殖,促进其凋亡[33],见图5、图6及图7。


图5 喉癌Hep-2细胞中let-7a mRNA的表达

图6 喉癌Hep-2细胞中HMGA2 mRNA的表达

图7 Western blot检测细胞中HMGA2蛋白的表达


1、4: 空白组,2、5: 阴性对照组,3、6: 实验组


C-myc是myc癌基因家族成员,在细胞增殖、生长和凋亡过程中具有重要作用,在人类恶性肿瘤中过量表达的let-7可使C-myc的mRNA和蛋白表达量下降,细胞活力下降,促使肿瘤细胞繁殖降低,增加化疗敏感性[34]。如图8A、8B和8C。


8 C-mycmRNA表达、蛋白表达及细胞活力测定

 

结语

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