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实验技术原理:
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、 面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来,由于电极尖端与细胞膜的高阻封接,在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此, 此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就代表单一离子通道电流。
实验操作流程:
1、标本制备:根据研究目的的不同,可采用不同的细胞组 织,如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等,现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞,必须满足实验要求,一般多采用酶解分离法,也可采用细 胞培养法;另外,由于与分子生物学技术的结合,现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道,如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。
2、电极制 备:合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证,一是设法造成干净的细胞膜表面,二是制成合格的电极。首先要 选择适当的玻璃毛细管,其材料可使用软质玻璃(苏打玻璃、电石玻璃)或硬质玻璃(硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃)。软玻璃电极常用于作全细胞记录,硬质玻 璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。
3、膜片钳实验系统:根据不同的电生理实验要求,可以组建不同的实验系统。
4、进行实验,记录和分析数据。
实验注意事项:
客户提供:
1、培养细胞:通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80℃,避免反复冻融);
2、实验信息:离子通道名称及亚型。
交付标准:
1、细胞膜电位的时程图
2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)
其他:
1、减少噪音,避免电极前端的污染,提高封接成功率,
2、记录模式,为记录特定离子电流
3、选择电极内、外液
4、选择阻断剂、激动剂
5、正确的数据采集
6、在形成高阻抗封接后,记录实验结果之前,通常要根据实验的要求进行参数补偿,以期获得符合实际的结果。
膜片钳使用的基本方法是,把经过加热抛光的玻璃微电极在液压推进器的操纵下,与清洁处理过的细胞膜形成高阻抗封接,导致电极内膜片与电极外的膜在电学上和化学上隔离起来,由于电性能隔离与微电极的相对低电阻(1~5MΩ),只要对微电极施以电压就能对膜片进行钳制,从微电极引出的微小离子电流通过高分辨、低噪声、高保真的电流-电压转换放大器输送至电子计算机进行分析处理。膜片钳技术实现的关键是建立高阻抗封接,并能通过特定的记录仪器反映这些变化,因而,膜片钳实验室除了一般电生理实验所需的仪器外,还特需防震工作台、屏蔽罩、膜片钳放大器、三维液压操纵器、倒置显微镜、数据采集卡、数据记录和分析系统等。
脑片电生理学研究 (mEPSC/mIPSC, LTP/LTD)
•红外可视脑片膜片钳脑或脊髓切片记录
•药物对兴奋性或抑制性突触前或突触后活动的分析,包括快速(配体门控离子通道介导的)或慢速(如GPCR介导的)的突触活动记录
•细胞外记录,包括长时程增强(LTP)或长时程抑制(LTD)的研究。例如:海马脑片场电位记录
案例1:
案例2
案例3
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