离子通道是一类膜蛋白，可以介导离子进入或者流出细胞。它们参与了几乎所有的生理过程，在调节细胞膜电位，细胞兴奋性以及细胞分泌诸多方面起着关键作用。离子通道的功能紊乱（malfunction）是重要的致病基础，因此离子通道也成为了现代新药研发中，被广泛关注的重要靶点。膜片钳电生理学仍然是一项主要研究离子通道的技术；由于目前还没有更简单的实验技术，可以直接测量离子通道的电信号，因此自从Neher和Sakmann于20世纪70年代细致描述单细胞膜片钳技术后，事实上，它一直被认为是研究离子通道的金标准。 传统的手动膜片钳记录方式，对实验者技术要求极为严苛，甚至被认为更是一种“艺术”；手动膜片钳，也无法实现中高通量的实验要求，很难满足现代药物研发的需求，由此，自动膜片钳设备，也便应运而生。从上世纪90年代，NeuroPatch对于电生理记录自动化的探索，历经30余年的发展，自动化膜片钳设备，在技术逻辑，数据质量以及行业应用度几个重要的维度，都获得了突破性的进展。1.自动膜片钳技术的演进。

最早的自动化膜片钳技术的探索，也是基于使用玻璃电极形成高阻封接：或者是利用机械手臂操作玻璃电极，或者是将细胞悬液注入到玻璃电极中。这两种方法，都没有取得足够的成功。其后，平面膜片钳技术（planar recordingchips）被认为是最为有效，也是最成功的全自动膜片钳模式，这一技术是将细胞悬浮液通过自动移液器应用于记录点的平面阵列，形成高阻封接，进行记录的。这种技术模式中，可以实现在一次实验中，同时得到多个记录。这一方法，成也为后续自动膜片钳系统的标准技术实现形式。但是第一代平面膜片钳技术，也存较多缺陷，例如实现高阻封接，需要额外使用”seal enhancer”.通常，seal enhancer中含有高浓度的钙离子，极大地限制了自动膜片钳技术使用的领域。在第二代基于平面膜片钳技术的自动化产品中，技术有了更大的进步，例如采用微流控制技术（micro-fluidics），实现了液体在测试位点，小体积，高效且快速的交换,这样大大降低了测试样品的用量；在提供足够高的检测通量的同时，实现了真正的高阻封结--high-quality GΩ seal recordings, 不再额外需要添加钙离子或者氟离子；最后，伴随细胞处理能力的提高，自动膜片钳成功率也获得了明显提升，伴随而来的是实验成本的显著降低。另外，我们也可以看到：自动膜片钳技术还具有独特的优势：可以更加便利的实现细胞内给药（例如通过细胞内液钙的调教，来研究TRPC5）而对于传统的手动膜片钳技术，是无法很好地满足需要细胞内给药的实验要求；更加便利的温度控制；更高效的液体交换技术，需要的液体很小，对于珍贵的样品而言是一个不容忽视的优势。也能满足对于快速脱敏的配体门控通道的记录要求；自动膜片钳技术，已经得到了科研领域和工业领域广泛的认可和使用，伴随越来越多的实验研究和工业应用，自动膜片钳技术得到了充分的考验和不断地完善。

A timeline showing the development of APC platforms, adapted from BellDC ect.

2. 自动膜片钳数据质量评估。早期的自动膜片钳技术的主要不足，在于很难形成真正的高阻封接。在实验中，往往会采用高浓度的钙离子，作为封接的促进剂（seal enhancer）。虽然在后续的实验操作中，高浓度的钙离子溶液会得到洗脱，依然会对后续的实验，产生较为负面的影响。在第二代以及后续开发的产品中，获得真实高阻封结的能力获得了较大的提升。同时诸如Qpatch系统，也成功地引入了电流钳记录模块。伴随技术的发展和迭代，整体实验体系的优化，保证了自动膜片钳实验，在高通量，高效率，低成本的同时，可以获得足以与手动膜片钳相比的数据质量。首先，稳定细胞系的获取和优化。在电生理实验中，表达外源基因的稳定细胞系是最为常用的检测对象。得到高质量的稳定细胞系，是电生理实验，尤其是自动膜片钳实验的关键。通常需要考虑的因素是宿主细胞背景，辅助亚单位的存在，基础电流污染，电流强度以及细胞间的均一性等等。适用于自动膜片钳系统的细胞，往往经过了多轮的单克隆筛选，以甄别出电流大小适宜，实验成功率高，阳性数据重复性好等优质的细胞克隆。 其次，严苛的质量控制。对于自动膜片钳系统，可以从多个维度进行质量控制，以确保良好的数据质量。质控参数1：关键性电生理学指标。这些参数的设定，可以来判断数据质量（initial cellcapture resistance (>10 MΩ), seal resistance (>1000 MΩ), currentamplitude (>200 pA), and recording stability by monitoring changes in cellcapacitance and series resistance）。在实验建立和优化过程中，这些参数的衡量，可以确保高质量的实验操作。检测液体的优化，多年自动膜片钳技术的发展，对实验中使用的液体，积累了大量的知识和经验，让研究者可以实现真实的高阻封接，获得稳定的电生理学记录；质控参数2：电流稳定性。电流升高和衰减（run-up & run-down）是电生理实验中极为严重的干扰因素。例如，在10分钟的记录期间，电压门控钠通道可能会出现20%或更多的衰减; 电压门控钙通道衰减程度则更为严重。封接质量变差，失活积累以及通道更迭（turnover）都会导致显著的电流衰减。通过具体实验条件设置（气压、电压强度的优化，各种对照的设置以及历史数据库的建立等等），在自动膜片钳系统，可以做到有效地预判和规避电流不稳定性带来的干扰。再者，通过精巧的设计，获得精确的工作液浓度控住。大多数自动膜片钳系统，都采用了微流控制技术（micro-fluidics），这项技术可以确保高效的液体交换，同时对工作液需要的体积也大大降低；主流的记录芯片一般会采用玻璃包被处理，从而大大降低了由于亲脂性分配（lipophilicpartitioning）所导致的药物吸附作用。通过技术上的、实验流程上的设计,自动膜片钳系统完全可以得到稳定且可靠的数据。我们在自己的实验室，比较了自动膜片钳和手动膜片钳实验系统中hERG的结果，显示了两者高度的一致性。Qpatch自身也呈现出较好的稳定性。

手动膜片钳和自动膜片钳的比较

3.行业中的数据积累从诞生以来，自动膜片钳系统在制药工业领域以及基础科研领域得到了广泛的应用，积累了大量的研究数据。自动膜片钳的发展，被看作近十几年来，制药领域主要的技术突破-- Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs andinnovation in the last decade.伴随应用的不断拓展，除了传统的电压门控的钾离子通道、钠离子通道之外，越来越多的离子通道，在自动膜片钳系统上得到了研究，为我们贡献和积累了大量的科研数据。例如对TREK-1 和TRPC5进行了通过细胞内液给药的研究，这样的实验对于手动膜片钳系统不是很便利，却可以在自动膜片钳系统上相对便利地完成；TRP系列靶点，在自动膜片钳系统上也到了充分的研究；还有很多配体门控的通道，包括P2X系列，nAChR受体，Glycine 受体， GABA受体等等。部分进入临床研究的药物，在Discovery阶段，就是凭借自动膜片钳系统，完成靶点的确认。

（A selection of drugs targeting ion channels developed using APCplatforms）

在2020年，多个国际制药巨头，共同发表了有关心脏安全性中多靶点抑制研究（包括hERG， Cav1.2，Nav1.5以及晚钠电流）。他们检测了CiPA范式下，所推荐的12种化合物（used for CiPAtraining and calibration）。他们所采用的正是各种主流的自动膜片钳实验平台。这预示自动膜片钳在药物研发乃至基础研究中，逐渐建立起了“标准”性地位。结语：随着自动膜片钳技术的发展，数据产生的通量得到了极大的飞跃，同时也显著地降低了进行离子通道研究的技术难度。我们相信，在学术界和工业界，这都会带来离子通道研究的重大进展。

Ref：1. Obergrussberger A, Friis S, Brüggemann A,Fertig N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs andinnovation in the last decade. Expert Opin Drug Discov. 2021 Jan;16(1):1-5.2. Annecchino LA, Schultz SR. Progress inautomating patch clamp cellular physiology. Brain and Neuroscience Advances.January 2018. 3. Bell DC, Dallas ML. Using automated patchclamp electrophysiology platforms in pain-related ion channel research:insights from industry and academia. Br J Pharmacol. 2018Jun;175(12):2312-2321. 4. Liu, C., Li, T., & Chen, J. (2019).Role of high-throughput electrophysiology in drug discovery. Current Protocolsin Pharmacology, 87, e69. 5. Annecchino LA, Schultz SR. Progress inautomating patch clamp cellular physiology. Brain and Neuroscience Advances.January 2018. doi:10.1177/23982128187765616. Mechanism-specific assay for Nav1.7inhibitors Tania Chernov-Rogan, Tianbo Li, Gang Lu, Henry Verschoof, KuldipKhakh, Steven W. Jones, Maureen H. Beresini, Chang Liu, Daniel F. Ortwine,Steven J. McKerrall, David H. Hackos, Daniel Sutherlin, Charles J. Cohen, JunChen Proceedings of the National Academy of Sciences Jan 2018, 115 (4)E792-E801;7. KramerJ, Himmel HM, Lindqvist A, Stoelzle-Feix S, Chaudhary KW, Li D, Bohme GA,Bridgland-Taylor M, Hebeisen S, Fan J, Renganathan M, Imredy J, Humphries ESA,Brinkwirth N, Strassmaier T, Ohtsuki A, Danker T, Vanoye C, Polonchuk L,Fermini B, Pierson JB, Gintant G. Cross-site and cross-platform variability ofautomated patch clamp assessments of drug effects on human cardiac currents inrecombinant cells. Sci Rep. 2020 Mar 27;10(1):5627.

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