爱思益普生物化学部（ICE Biochemistry, IBC）成立于2019年2月18日，经过近五年的发展，已经成长为涵盖蛋白定制与产品，生物物理分析，酶学体系构建与筛选，生化机制研究，质谱分析，高通量与谱学筛选的六位一体的生物化学平台；团队经验丰富，leader团队超过25人，平均行业从业经验超过6年，拥有1100+的ready to use的酶学靶点平台，300+的靶标蛋白产品，以及100+经SPR验证的assay平台等，助力国内外合作伙伴的新药研发。

表面等离子共振（SPR）技术背景及应用介绍

表面等离子共振(SPR)是一种基于物理光学原理发展而来的用于检测分子相互作用的生物物理学技术。该方法可实时高灵敏度地检测分子间相互作用且无需标记。SPR利用光在不同介质中产生消逝波后与等离子波产生共振，进而可以构建生物分子相互作用的生物传感分析技术，用以检测生物传感芯片上配体与分析物之间的相互作用情况。在实验中，将其中一个待测量的分子固定在芯片表面，而另一分子以流动的方式流经芯片表面。该分析物与配体产生相互作用，当分子发生结合和解离时，芯片表面质量变化造成共振角发生变化，传感图会实时记录相互作用下的信号值，根据此变化曲线，可拟合得出分子间相互作用的结合速率常数ka (1/Ms)、解离速率常数kd (1/s)和平衡解离常数/亲和力常数KD (M)，动力学常数表示结合/解离的快慢，亲和力常数表示结合的强弱。

图1.  表面等离子共振仪工作原理

Biacore™ SPR仪器可获取亲和力、特异性和动力学实时数据。SPR技术作为研究分子互作的金标准，于2016年被列入美国和日本药典，并于2020年被列入中国药典。目前SPR已被公认是确定多种类型分子结合过程中的特异性、亲和力和动力学参数的最强大技术之一，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质- DNA、酶-底物或抑制剂、受体-药物、脂膜-蛋白质、蛋白质-多糖、细胞或病毒-蛋白质等^[1]。该技术可用于蛋白相互作用研究、大小分子药物发现、抗体筛选与精确表征，已广泛应用于生命科学、医学诊断、食品安全及环境检测等领域。

在对埃博拉病毒入侵机制的研究中，NPC1分子是负责胆固醇转运的多次跨膜蛋白，也是埃博拉病毒 (EBOV) 的细胞内受体。中科院利用SPR技术检测出埃博拉病毒糖蛋白GPc l以低亲和力与NPC1-C结合，且二者的亲和力与pH密切相关，最终发现了埃博拉病毒在酸性环境下更容易传播的机制^[2,3]。

图2  SPR 测试 EBOV-GPcl 和 NPC1的在不同pH下的结合亲和力。

固本咳喘汤（GBKC）是由七味药组成的著名处方，已广泛用于治疗慢性支气管炎（CB）。然而，GBKC的药理成分以及这些成分作用于CB的潜在机制仍不清楚。北京中医药大学结合系统药理学和SPR技术，使用Biacore 8K筛选分子对接得到的20组活性化合物-靶点，并利用得到的动力学特征发现分子间结合特征的差异，助力先导化合物的发现^[4]。2021年FDA批准了Tisotumab vedotin-tftv用于治疗宫颈癌。Tisotumab vedotin是一种靶向组织因子（tissue factor，TF）的抗体药物偶联物（ADC），TF在宫颈癌细胞上表达，可促进肿瘤生长、血管生成和转移。在这款药物的研发与申报中，他们利用Biacore测定了TF-TCB与CD3D CD3E异源二聚体和TF抗原的结合亲和力分别为14.9和0.839 nM，与临床试验中的其他TCBS相当^[5]。

图3  首个靶向组织因子抗体偶联药物TIVDAK

爱思益普SPR生物物理筛选平台介绍

SPR技术应用广泛，方法成熟，涉及Biacore仪器的全球发表文章数超过4万篇，中国超过8千篇。SPR检测具备样品无需标记、实时分析、准确定量的特点。我们公司目前使用的是Biacore 8K，它有8根进样针、16组检测通道，能够平行检测至少8种不同样品，从而能快速高效的得到动力学和亲和力数据。目前我们已经拥有成熟的方法开发体系，具有100+ 经SPR验证的靶标平台，助力国内外合作伙伴的新药研发，下面具体介绍一些我司已开发的SPR assay平台。

KRAS Panel SPR结合实验

KRAS是一种鼠类肉瘤病毒癌基因，属于鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白，被称为RAS超家族或RAS样GTP酶。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS。ICE生物物理团队现已开发出稳定的KRAS、NRAS、HRAS测试体系，可以提供针对KRAS，NRAS以及HRAS与小分子结合的SPR评价方法。

图4  BI-2852与 GDP状态下的KRAS, HRAS, NRAS的结合SPR传感图

在RAS基因中，KRAS是最常见的突变异构体，占RAS突变的86%，对人类癌症影响最大。KRAS具有GTP水解酶活性，当其与GDP结合时，处于非激活状态(关)，而与GTP结合时被活化(开)^[6]。鸟嘌呤核苷酸交换因子促进GTP与RAS结合，继而激活MAPK、PI3K等多条信号通路。一旦发生突变，就会丧失GTP水解酶活性，进而持续活化，促使细胞持续增殖而癌变。ICE可提供不同状态KRAS突变体与小分子的结合亲和力测试，包括GDP、GTP 、以及GTP的非水解类似物GMPPNP和GPPNHP。

图5 MRTX1133与KRAS WT、G12C、G12D、G12V GDP-bound和GTP-bound, GMPPNP-bound, GppNHp-bound的SPR亲和力测试

c-Cbl和Cbl-b SPR亲和力、选择性测试

c-Cbl和Cbl-b是Cbl (CasitasB-lineagelymphoma)家族的重要成员，c-Cbl是一种普遍表达的哺乳动物基因，在细胞生存、迁移和增殖等基本细胞功能中起着至关重要的作用。Cbl-b是一种环指E3泛素连接酶，在多泛素化和单泛素化过程中起核心作用，在免疫反应的调节中起关键作用，并且已被确定为适应性免疫反应的关键调节因子。Cbl-b是建立T细胞激活阈值和通过多种机制调节外周T细胞耐受性所必需的。Cbl-b也调节先天免疫反应，并在宿主防御病原体和抗肿瘤免疫中发挥关键作用^[7]。

c-Cbl在生长因子受体调节中具有广泛的功能，并且在没有c-Cbl和Cbl-b的情况下，对于一些通路的调控异常有很强的放大作用，因此具有Cbl-b选择性的化合物很可能作为肿瘤免疫治疗药物而具有很高的选择性。ICE现已开发出稳定的c-Cbl、Cbl-b SPR测试体系，提供针对c-Cbl、Cbl-b与小分子结合的SPR评价方法。

图6  SPR方法测试小分子在Cbl-b和c-Cbl 上的选择性

PROTAC筛选体系

近年来蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTAC）技术作为一种新的治疗手段，通过使用PROTACs进行靶向蛋白质降解，在抗肿瘤药物领域中得到了广泛的研究。

图7  泛素-蛋白酶体途径中的PROTAC

PROTAC能够快速、可逆、高效、便捷地调控靶蛋白，有望为体内外靶蛋白的动态调控提供新的策略。与传统的小分子抑制剂相比，小分子PROTAC降解蛋白的优势在于PROTAC化合物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合，因此可以作为一种有用且独特的工具，以时间依赖性和剂量依赖性的方式降解目标蛋白，并且目标蛋白的降解是可逆的^[8]，可以利用小分子特异性降解靶蛋白，靶向传统难以成药的蛋白靶点。表面等离子共振技术（SPR）可直接测量二元以及三元复合物的亲和力，可用于PROTAC、分子胶、PPI等三元复合物的筛选以及动力学研究。ICE生物物理团队现已开发出稳定的BRD4 & MZ1 & VHL三元复合物SPR测试体系。

图8  已开发的BRD4 & MZ1 & VHL三元复合物SPR测试体系

抗体是人体适应性免疫产生的效应分子，在疾病治疗尤其是抗肿瘤治疗中具有重要作用。在抗体药物研发与申报项目的生物活性分析中，可借助SPR技术进行抗体与Fc受体、抗原等的亲和检测。

抗体与Fc受体

抗体药物可通过Fc结构域与不同类型的Fc受体（包含FcᵧR或FcRn）相结合而发挥效应功能，FcᵧR位于免疫细胞表面，可以调控细胞免疫反应，在抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性的细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)等过程中发挥作用，FcRn可通过结合抗体影响药物半衰期。^[9] SPR技术是Fc/FcᵧR生物活性常用表征方法之一，已被广泛应用于结合实验的测定。ICE目前可提供8 种Fc受体结合分析检测，使用高通量的Biacore 8K仪器可以检测很多IgG抗体和Fc受体之间的结合亲和力（KD）。下面展示部分Fc受体与Erbitux的亲和力测试结果。

图9  Erbitux与FcᵧR或FcRn之间的结合亲和力表征

抗体与抗原

HER2蛋白是酪氨酸蛋白激酶家族中的一员，它在正常情况下会参与细胞生长和分裂过程中的一些调控，但当其过度表达时会导致癌细胞的快速增殖形成肿瘤^[10]。HER2靶向抗体及抗体药物偶联物（ADC）是目前HER2过表达癌症靶向治疗最主要的一些手段，SPR技术在抗体类药物及ADC药物的研发过程中可以评估抗体特性，促进靶向药物的开发。ICE目前已借助Biacore 8K开发出Herceptin与HER2的结合分析检测方法，除HER2靶标外，我们还开发了西妥昔单抗与EGFR的结合分析检测方法（结果如图），助力合作伙伴发现靶向HER2和EGFR的治疗药物。

图10  Erbitux与EGFR, Herceptin与HER2的结合亲和力

小结：

ICE可以检测多种分子间相互作用亲和力，包括蛋白与小分子、蛋白与蛋白、蛋白与多肽的亲和力；抗原与抗体、抗体及Fc融合蛋白、抗体与Fc受体的结合亲和力、结合/解离速率常数；候选分子筛选排序等等。

爱思益普生物化学部（IBC）目前已开发超过100+ SPR assay，更多ready to use SPR靶点assay持续更新中，有SPR实验方法开发、验证、筛选的相关需求，欢迎咨询。

参考文献

1 Nguyen HH, Park J, Kang S, Kim M. Surface plasmon resonance: a versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 2015 May 5;15(5):10481-510. doi: 10.3390/s150510481. PMID: 25951336; PMCID: PMC4481982.

2 Wang H, Shi Y, Song J, Qi J, Lu G, Yan J, Gao GF. Ebola Viral Glycoprotein Bound to Its Endosomal Receptor Niemann-Pick C1. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):258-268. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.044. PMID: 26771495; PMCID: PMC7111281.

3 Gong X, Qian H, Zhou X, Wu J, Wan T, Cao P, Huang W, Zhao X, Wang X, Wang P, Shi Y, Gao GF, Zhou Q, Yan N. Structural Insights into the Niemann-Pick C1 (NPC1)-Mediated Cholesterol Transfer and Ebola Infection. Cell. 2016 Jun 2;165(6):1467-1478. doi: 10.1016/j.cell.2016.05.022. Epub 2016 May 26. PMID: 27238017; PMCID: PMC7111323.

4 Luo Z, Yu G, Wang W, Sun R, Zhang B, Wang J, Liu J, Gao S, Wang P, Shi Y. Integrated Systems Pharmacology and Surface Plasmon Resonance Approaches to Reveal the Synergistic Effect of Multiple Components of Gu-Ben-Ke-Chuan Decoction on Chronic Bronchitis. J Inflamm Res. 2021 Apr 15;14:1455-1471. doi: 10.2147/JIR.S303530. PMID: 33883922; PMCID: PMC8055291.

5 Pan Z, Chen J, Xiao X, Xie Y, Jiang H, Zhang B, Lu H, Yuan Y, Han L, Zhou Y, Zong H, Wang L, Sun R, Zhu J. Characterization of a novel bispecific antibody targeting tissue factor-positive tumors with T cell engagement. Acta Pharm Sin B. 2022 Apr;12(4):1928-1942. doi: 10.1016/j.apsb.2021.10.028. Epub 2021 Nov 3. PMID: 35847491; PMCID: PMC9279644.

6 Liu P, Wang Y, Li X. Targeting the untargetable KRAS in cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 2019 Sep;9(5):871-879. doi: 10.1016/j.apsb.2019.03.002. Epub 2019 Mar 6. PMID: 31649840; PMCID: PMC6804475.

7 Thien CB, Langdon WY. c-Cbl and Cbl-b ubiquitin ligases: substrate diversity and the negative regulation of signalling responses. Biochem J. 2005 Oct 15;391(Pt 2):153-66. doi: 10.1042/BJ20050892. PMID: 16212556; PMCID: PMC1276912.

8 Shi Y, Liao Y, Liu Q, Ni Z, Zhang Z, Shi M, Li P, Li H, Rao Y. BRD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates. Cell Discov. 2023 May 9;9(1):47. doi: 10.1038/s41421-023-00544-0. PMID: 37156794; PMCID: PMC10167318.

9 Hayes JM, Frostell A, Karlsson R, Müller S, Martín SM, Pauers M, Reuss F, Cosgrave EF, Anneren C, Davey GP, Rudd PM. Identification of Fc Gamma Receptor Glycoforms That Produce Differential Binding Kinetics for Rituximab. Mol Cell Proteomics. 2017 Oct;16(10):1770-1788. doi: 10.1074/mcp.M117.066944. Epub 2017 Jun 2. PMID: 28576848; PMCID: PMC5629263.

10 Swain SM, Shastry M, Hamilton E. Targeting HER2-positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discov. 2023 Feb;22(2):101-126. doi: 10.1038/s41573-022-00579-0. Epub 2022 Nov 7. PMID: 36344672; PMCID: PMC9640784.